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Hygiene Report 1/2022

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HYGIENE Report ist das Forum für Qualitätssicherung in der Lebensmittel- und Getränkeindustrie. In Zusammenarbeit mit hochkarätigen Autoren aus Wissenschaft und Wirtschaft berichtet das Periodikum anwenderorientiert und praxisnah zu allen relevanten Aspekten rund um das Thema Qualitätssicherung. Themen sind beispielsweise Hygiene Management, Messtechnik, Berufskleidung, Reinigung, HACCP, Personalhygiene und mikrobiologische Nachweise mit all ihren rechtlichen und gesetzlichen Problemen.

wissenschaft 1·22

wissenschaft 1·22 Pyrogenen auf der Spur: Mit ES-Puffer gelingt Nachweis von Endotoxin bei LAL-Reagenzien Lebensmittel schützen: Detektions-Gerinnungsfaktor aus Blut des Pfeilschwanzkrebses Feste Lebensmittel, Ei- oder Fleisch-/Fischprodukte: Vor dem Marktrelease müssen Nahrungsmittel sowie deren Rohstoffe im Rahmen der Produktion auf Keimfreiheit überprüft werden. Insbesondere bakterielle Endotoxine dürfen nicht in den menschlichen Organismus gelangen, da diese Zellmembran-Bestandteile gramnegativer Bakterien schweres Fieber auslösen können, das gerade bei geschwächten Patienten tödlich verlaufen kann. Eine Kontamination während der Herstellung sollen spezielle Grenzwert-Tests (BET/LAL) ausschließen, deren Grundlage ein bestimmter Faktor, gewonnen aus dem Blut von Pfeilschwanzkrebsen, bildet. In Gegenwart von Endotoxin reagiert dieser mit dem Erreger, wodurch eine biochemische Gerinnungsreaktion ausgelöst wird. Anhand der Gelbildung lässt sich die Kontamination nachweisen. Jedoch können Interferenzen wie ein schwankender pH-Wert oder Pilzbestandteile etwa aus pflanzlichen Probenzusätzen den Gerinnungsmechanismus ebenfalls auslösen und potenziell falsch-positive Ergebnisse hervorrufen. Um diese Interferenzen zu unterbinden, bietet die FUJIFILM Wako Chemicals Europe GmbH (Neuss) einen Endotoxin-spezifischen (ES) Puffer für unbehandelte LAL-Reagenzien an. Er ist bereits für sämtliche gängige Nachweisverfahren formuliert und einfach in der Handhabung, sodass er ohne großen Aufwand in die Qualitätskontrolle integriert werden kann. Während alle von Fujifilm Wako hergestellten LAL-Reagenzien bereits Endotoxin-spezifisch sind, gilt dies für andere handelsübliche Reagenzien nicht. Diese werden mit dem ES-Puffer als Zusatz nun Endotoxin-spezifisch, wodurch eine Bestimmung der tatsächlichen Endotoxin-Konzentration in der Probe ermöglicht wird. Eine Umstellung auf andere Testsysteme ist nicht nötig. Endotoxine sind sehr hitzestabil, widerstehen vielen gängigen Sterilisationsmethoden und benötigen auch keine lebensfähigen Bakterien für ihre Aktivität. Gelangen sie z.B. über die Nahrung während der Verdauung in den Blutkreislauf von Mensch und Tier, reagieren diese mit Immunzellen und lösen eine starke Entzündungsreaktion mit Fieber aus. Insbesondere bei geschwächten Personen oder Dialysepatien ten kann dies sogar zum Tod führen. Der atlantische Pfeilschwanzkrebs (Limulus polyphemus) besitzt ein spezielles Immunsystem: Kommt das blaue Blut der Urzeitkrebse mit selbst kleinsten Mengen an Endotoxin in Kontakt, wird als Immunantwort ein Gel um das Pathogen herum gebildet, das eine weitere Infektion der verletzten Stelle verhindern soll. Dafür sorgt ein Eine Kontamination mit Endotoxin während der Herstellung von Lebensmitteln sollen Grenzwert-Tests (BET/LAL) ausschließen, deren Grundlage ein spezieller Faktor aus dem Blut der Pfeilschwanzkrebse bildet. Faktor im Blut der Tiere, der als Grundlage für den Bakterien- Endotoxin-Test (BET) bzw. den Limulus-Amöbozyten-Lysat (LAL)-Test dient. Dieser wird häufig zur Überprüfung von Eiprodukten genutzt, die zur Weiterverarbeitung etwa in Teigwaren vorgesehen sind. Darüber hinaus lassen sich mit dem schnellen und hochempfindlichen Test tote und lebende gramnegative Bakterien in flüssigen und festen Lebensmitteln, Fleischprodukten und anderen Rohstoffen zur Nahrungsmittelherstellung nachweisen. Der Gerinnungsfaktor aus den Blutzellen (Amöbozyten) der Pfeilschwanzkrebse wird den Tieren nachhaltig entnommen – jedem nur eine kleine Menge in großen Abständen. Zudem werden sie medizinisch untersucht und innerhalb von 24-48 Stunden nach der Entnahme der Blutproben wieder an ihren angestammten Lebensort gebracht. Zum Schutz der Tiere hat sich Fujifilm Wako zudem mehreren Organisationen, u.a. dem Horseshoe Crab Conversation Fund und dem US Fish and Wildlife Service, angeschlossen. „Viele Lebensmittel und deren Rohstoffe können während der Vorbereitungs-, Produktions- oder Verpackungsphasen kontaminiert werden, etwa durch ungenügende Reinigung der Prozessanlagen oder bereits kontaminierte Rohmaterialien wie angelieferte Milch“, berich- 20 www.hygiene-report-magazin.de

Februar wissenschaft tet Yannic Werner, Sales Manager Laboratory Chemicals bei der FUJIFILM Wako Chemicals Europe GmbH. „Mit dem Test soll Kontamination vor Verkauf und Verzehr ausgeschlossen werden.“ Jedoch reagieren unbehandelte LAL-Reagenzien ebenso mit Pilzzellwandbestandteilen – genauer: mit Beta-Glucan –, die ebenfalls die Gerinnungskaskade einleiten. Dann entsteht ein falsch-positives BET-Ergebnis. Auch Interferenzen wie ein schwankender pH-Wert der Probe, der etwa durch Zugabe eines sauren Mediums bei der Formulierung hervorgerufen wird, können die Genauigkeit des Endotoxin- Nachweises stören. ES-Puffer verhindert falsch-positive Ergebnisse Deshalb bietet die FUJIFILM Wako Chemicals Europe GmbH, eine Schwesterfirma der USamerikanischen FUJIFILM Wako Chemicals U.S.A. Corporation, einen Endotoxinspezifischen Puffer an, der die Aktivierungskaskade der Pilze blockt und nur diejenige der gramnegativen Bakterien zulässt. Der ES-Puffer wird v.a. bei der Untersuchung von falschpositiven Reaktionen eingesetzt, die durch das Vorhandensein von Beta-Glucanen hervorgerufen werden. Der Puffer ist dabei für alle gängigen und unbehandelten LAL-Verfahren verschiedener Hersteller als Zusatz geeignet. Erhältlich ist der ES-Puffer einzeln oder als fester Bestandteil Endotoxinspezifischer Reagenzien der Wako-Produktreihe. Eine Puffer-Lösung kann kleine Mengen an zugegebener Säure oder Base neutralisieren und so den pH-Wert einer Lösung stabil halten. „Damit bei unbehandelten LAL-Reagenzien der Einfluss von Beta-Glucan auf die Endotoxin-Detektion vermieden wird, enthält unser Puffer zusätzlich einen speziellen Faktor, der die Kaskade für Beta-Glucan sättigt und so den Test unempfindlich gegenüber Beta-Glucan macht“, so Werner. Sofern Endotoxin vorhanden ist, wird nur deren Aktivität zugelassen und eine Gerinnungsreaktion ausgelöst. Der Mechanismus beruht auf einer Kaskade von zwei Serinproteasen, die als Faktor B und Faktor C bezeichnet werden. Bei Aktivierung des gerinnungsfördernden Enzyms wandeln sie das Progerinnungsenzym in seine aktive Form um, was zur Spaltung des Koagulogens in ein unlösliches Gerinnungsgel und zur Erhöhung der Trübung der Lösung führt. Dieser Zusammenhang macht es möglich, qualitative oder quantitative Effekte zu beobachten, also Endotoxin nachzuweisen und auch die genaue Menge vorhandenen Endotoxins zu bestimmen. Denn Kommt das Blut des atlantischen Pfeilschwanzkrebses in Kontakt mit Endotoxin, wird ein Gel um das Pathogen herum gebildet, um weitere Infektion zu verhindern. die Trübungsmessung und Farb änderung ist proportional zum Endotoxingehalt. Die Anwendung der ES-Produkte ist einfach. Nur auf die maximal gültige Verdünnung ist zu achten. Quelle: FUJIFILM Wako Chemicals Europe GmbH Der Test selbst kann mit einer von drei Methoden durchgeführt werden: Gelgerinnung, kinetisch-turbidimetrisch (KTA) oder kinetisch-chromogen (KCA). Bei der Gelgerinnung erfolgt die Bestimmung qualitativ, das Ergebnis zeigt nur das Vorhandensein von Endotoxin an. Mit den kinetischen Verfahren lässt sich der Endotoxingehalt quantitativ bestimmen. Dabei kann entweder ein Mikroplatten-Reader oder ein Tube-Reader, wie z.B. das Toxinometer ® Analysis System von Wako, verwendet werden, um automatisch die Absorptionsänderung, die über einen bestimmten Zeitraum auftritt, photometrisch zu erfassen. Die Zeit ist dabei umgekehrt proportional zum vorhandenen Endotoxin. Der ES-Puffer von FUJIFILM Wako ist bereits für alle drei Verfahren formuliert. Jedes Fläschchen enthält eine Lösung für die Rekonstitution von 6 ml Reagenz. Die Vials sind vorgefertigt, sodass das LAL-Reagenz einfach hineinpipettiert werden kann, was zudem auch zu geringeren Kontaminationsquellen führt. Die einfache Handhabung ermöglicht es, die Bestimmung in kurzer Zeit durchzuführen. ES-Puffer Bestandteil der LAL-Reagenzien FUJIFILM Wako bietet den Puffer als einzelne Lösung zum Zusetzen unbehandelter LAL-Reagenzien an, er ist auch bereits Bestandteil ihrer ES- Reagenzien. „Jedes Reagenz enthält Pufferkomponenten, die dazu beitragen, die meisten Testmischungen in den pH-Bereich zu bringen, der für genaue und zuverlässige Ergebnisse erforderlich ist“, erklärt Werner. „Sie können einfach mit Endotoxin-freiem Wasser ohne Bedarf an weiteren Zusätzen oder einem Puffer für die BET- Tests eingesetzt werden.“ Dabei ist nur auf die maximal gültige Verdünnung (MVD) zu achten: Je mehr Interferenzen auftreten, desto höher muss diese ausfallen. Dank dieser effektiven Formulierung mit enthaltenden Pufferkomponenten sind Doppel- und Dreifachbestimmungen in gleichbleibend hoher Qualität durchführbar. Werner:„Für Routinetests im Qualitätskontrolllabor bleibt es von entscheidender Bedeutung, eine reproduzierbare und robuste Testmethode zu etablieren, um jede Reaktion zweifelsfrei auf Endotoxin zurückführen zu können. Mit unseren ES- Reagenzien und dem Puffer ist dies sichergestellt. Letzteres ist in erster Linie für unbehandelte, handelsübliche LAL-Reagenzien gedacht, die bereits in der QC etabliert sind. Mit wenig Aufwand können diese Tests Endotoxin-spezifisch gemacht werden, ohne auf neue Systeme umsteigen zu müssen.“ FUJIFILM Wako Chemicals Europe GmbH Fuggerstraße 12 D-41468 Neuss www.labchem-wako.fujifilm.com www.wakopyrostar.com 21

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